流式細胞儀測量的數據是相對值，因此需要在使用前對系統進行校準或標定。流式細胞儀的校準有二個目的，即儀器的準直調整和定量標度。通常使用標準微球作為非生物學標準樣品，雞血紅細胞做為生物學標準樣品。

3 主流流式細胞儀型號及其特性介紹

目前擁有市場較大份額的公司是美國的BD（Becton-Dickinson）公司、Beckman-Coulter公司（原名稱Coulter）和德國的Partec公司。

3．1 BD公司流式細胞儀介紹 BD公司生產的流式細胞儀都冠以FACs（fluorescence activated cell sorter），即熒光激活細胞分選器。其型號種類比較齊全，如早期的FACSort、FACS Canto、FACSean。現在市場上供應的型號有五種：FACSCount（小型流式細胞儀）、FACS CAlibur（流式細胞儀）、FACSA ria（流式細胞分選儀）、FACSV antage SETM（多色分析和高速分選流式細胞儀）、LSR II（數字化分析型流式細胞儀）。

FACSCount為精確計數淋巴細胞CD3，CD4，CD8絕對數而設計的。FACSCalibur是全自動多色流式系統，偏重于臨床，其整體設計幫助臨床醫生快速實現常規免疫表型、CD4T細胞計數、DNA、網織紅細胞、血小板等臨床分析，兼具分選功能。配備有二根激光管，可同時檢測4個熒光參數。可識別粘聯細胞。

BD FACSA ria流式細胞分選儀為臺式高速細胞分選儀，獲取速度達70，000細胞/s，分析速度達50，000/s。使用石英杯流動檢測池固定光路校準技術。使用三種激光，多色分析，分析參數可達15色。兩管或四管分選，可以使用多種規格的收集管。液流監測系統白動監測液流斷點，檢查堵塞，實現了細胞分選的無人操作。配件BDACDU裝置，可以在微孔板或載波片上定量分選細胞。

FACSV antage SETM是在FACSV antage的細胞分選功能基礎上推出的分選增強型流式細胞儀。六色熒光分析系統，點對點分選，配置FACS Diva數字化系統，提供全面的配套試劑。速度和功能優于FACSV antage。 BD LSR II是LSR的數字化升級版，其性能介于FACSV antage SE和FACS Calibur之間，是專為生命科學研究設計的臺式機。配備固定校準的紫外激光，四種激光立體空間激發、十色熒光同時分析、電子系統數字化、比較易學易用。

3．2 Beckman-Coulter公司流式細胞儀介紹 Beckman- Coulter公司生產的流式細胞儀以Profile（早期，現已停產）和EPICS系列為代表，近年又推出了Cytomics FC500系列。EPICS系列是大型流式細胞儀，目前市場上有XL、XL-MCL和ALTRA三種型號，其中ALTRA具有分選功能，適用于免疫學、細胞生理、分子生物學、遺傳學、微生物學、水質分析和植物細胞分析。Cytomics FC500系列流式細胞儀體積小，可自動進行5種顏色的分析，適用于免疫學檢測，如人類HIV診斷。特別是FC500MPL的獨特設計可以在同一系統上使用12×75mm的離心管和24或96孔的平板。特別適合工作量大的實驗室。

這二個公司主要針對醫學研究和臨床工作進行設計和生產，其產品可應用于生物醫學基礎研究以及臨床檢

測的許多領域，如遺傳、腫瘤、血液、免疫等諸多研究中紅細胞、T細胞、淋巴細胞亞群測定、檢測早期細胞凋亡、腫瘤細胞免疫測定等。這二個公司的流式細胞儀價格昂貴，我國主要購買、使用的單位基本上都是一些醫療機構。

3．3 Partec公司流式細胞儀介紹 與BD和Becman-Coutler公司的產品相比，德國Partec公司生產的流式細胞儀的共同特點是體積小，造價低，易操作，便于攜帶，適合植物學研究，適合邊遠地區和發展中國家。德國Partec公司的產品分為三類：CCA家族、PAS家族和CyFlow家族（Galaxy為早期產品，已停產）。CCA家族包括細胞計數分析儀CCA和倍性分析儀PA-I。它是單或雙參數的臺式小型機，可以進行一些常規分析，如核DNA測定（檢測倍性或細胞周期）、細胞計數、細胞凋亡。它的特點是體積小，易操作，價格低，檢測范圍廣，可以檢測多種熒光素（如PI、DAPI、Fluorescein）發出的熒光。PAS家族包括粒子分析系統PAS、粒子分析系統III（PAS-III）和倍性分析儀PA-II。提供三種激光器的三種組合，可檢測十余種熒光染料。最多可檢測和記錄八個獨立熒光參數。倍性分析儀PA能夠在2分鐘內自動測量植物的倍性水平，檢測異倍體。可以對葉片、幼苗、種子、果皮、根、花等植物材料進行分析。在大多數植物中，異倍體染色體的檢測分辨率為±1條染色體。PA-I使用HBO-100汞燈，屬于弧光燈，可產生紫外激發光和藍光。PA-II中增加了488nm氬離子激光器，能夠檢測幾乎所有的熒光染料，如DAPI，Hoeehst，PI，EB，MMC，FITC，FDA等。汞燈發光是電流經過氣體時，氣體電離產生的。它能提供最佳的激發波長。

CyFlow（R）SL配備三種激光管，可應用于諸如人類健康、微生物學、工業應用、過程控制、生態學等研究。如HIV掃描中免疫標記細胞計數、食品處理過程中的微生物計數、細胞凋亡等。它使用l2 V直流電，特別適合邊遠地區和發展中國家。

國際上20世紀80年代開始將流式細胞儀檢測應用到植物的研究中（Galbraith，1983），眾多學者都認為流式細胞儀是一種準確、快速的檢測DNA含量的方法（Michaelson，1991）。應用范圍主要是利用流式細胞儀研究屬內、屬間多種植物的DNA含量（Baird，1994；Jacob，1996；HALL，2000）和倍性水平（Costich，1993；Meng，2002）、檢測體細胞雜種（Pfosser，1995；Keller，1996）和游離小孢子培養再生株（Kim，2003）的DNA含量。過去我國應用這一檢測技術的植物研究工作者寥寥無幾，且大多是在國外實驗室完成的。研究內容包括植物生理、程序性死亡、倍性鑒定等。植物研究中使用的流式細胞儀基本上都是Partec公司的產品，也有少量是BD公司生產的流式細胞儀。BD公司的產品主要定位于醫學研究與應用，與Partec產品相比，不太適合從事植物染色體倍性的鑒定。主要體現在不能提供植物樣品制備技術/試劑，數據獲取軟件可同時檢測到的倍性數目少。鑒于目前我國科研院所中使用較多的是BD公司生產的流式細胞儀，在下一篇中將會對利用BD流式細胞儀進行植物倍性檢測的技術和技巧做詳細報告。

如何選擇流式細胞儀

自七十年代出現第一代流式細胞儀以來，隨著計算機技術、電子制造技術、激光技術及熒光素合成技術的不斷發展，現代流式細胞儀已今非昔比，制造工藝、功能、精確度有了質的飛躍。

流式細胞儀生產廠商推出各種不同型號的流式細胞儀來滿足用戶的不同需要。現生產流式細胞的廠商全球至少有六家，各廠商產品又有不同的系列，各具特點。如何從眾多的型號中挑選出最適合自己的機型，我們還需從分析應用出發，評估自己的需求來決定什么樣的流式細胞儀最具性價比、最適合自己。 ⑴、DNA倍體分析

DNA分析是流式細胞儀最初且是現在應用最廣檢測項目。由于惡性細胞DNA含量通常與正常細胞不同，存在異倍體細胞，所以現有很研究評價異倍體細胞與腫瘤惡性度及其預后的關系。DNA含量檢測還可提供細胞周期方面的信息，這在細胞生物學中運用很廣泛。特別地，它可表示出細胞毒性藥物對細胞作用過程。這些DNA檢測還可與細胞表面標志物標記同時進行，這樣在細胞混合培養中，可通常追蹤表達特異標志物的細胞顯示其生長周期情況。所有方法都是基于染料能與核酸起特異的化學反應并發射出熒光，常用的染料為PI，DAPI。

流式細胞儀要求：488nm光源，575nm濾光片。

⑵、細胞生存能力實驗

使用Heochest 33342染料與DNA特異性結合，后因細胞活力不同，染料的結合程度也各異，故可評估細胞的活性度。

流式細胞儀要求：360nm光源，455nm濾光片。

⑶、計數外周血中檢測網織紅細胞

使用TO染料能夠特異性地與RNA結合，結合系數高達3000，故具有很好的性價比。

流式細胞儀要求：488nm光源，525nm濾光片，液量絕對計數系統。

⑷、外周血、骨髓采集物中CD34陽性干細胞計數，臨床上用于骨髓移植前干細胞數理的測定

使用標準ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE標記CD34抗體，PE-CY5標記CD45抗體。 流式細胞儀要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片，液量絕對計數系統。

⑸、交叉淋巴細胞、粒細胞毒實驗

檢測識別供體血清中免疫球蛋白與受體粒細胞之間是否存在反應有著重要臨床意義，因為這種反應會導致移植后發熱、移植后肺損傷及免疫性粒細胞缺乏癥。流式細胞儀可檢測全血樣本與血清孵育后粒細胞上結

合的人免疫球蛋白。FITC標記人免疫球蛋白抗體、PE標記粒細胞表面標志物、PE-CY5標記HLA抗體。 流式細胞儀要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片。

⑹、血小板自身抗體檢測

血小板自身抗體識別人血小板抗原，會引起各種臨床相關癥狀，如新生兒自免性血小板減少癥、輸血后紫癜、難治性血小板減少。流式細胞可快速準確地檢測血小板自身抗體。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別血小板抗體。

流式細胞儀要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片。

⑺、移植交叉配型

原細胞毒實驗，主要用于避免移植物超急性排拆反應。流式細胞儀用于監測T或B細胞是否受到受體血清中免疫球蛋白攻擊，作為HLA配型前的預實驗。流式細胞儀因其高精確性已成為該領域內的金標準。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別T細胞CD3或B細胞CD29抗體。

儀器要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片。

⑻、檢測細胞經抗原或細胞有絲分裂刺激后活化效應

淋巴細胞早期活化指標CD69可用來檢測免疫治療效果。流式細胞使用三色分析可監測淋巴細胞各亞群活化情況：FITC標記的CD3抗體、PE標記的CD8抗體、PE-CY5標記的CD69抗體。

流式細胞儀要求：488nm光源，525nm、575nm、575nm濾光片。

⑼、檢測細胞內因子（TH1/TH2細胞檢測）

未活化的淋巴細胞所分泌的細胞因子極少，用流式細胞儀很難檢測出來，因此在檢測前需刺激活化。活化所用的刺激素為PMA 佛波酯+Ionomycin。淋巴細胞在刺激素的作用下，活化分泌細胞因子到細胞外。因流式細胞儀只能對細胞表面或內部的抗原進行檢測，如細胞因子分泌到細胞外則檢測不到，因此必須阻止細胞因子的分泌。抑制細胞因子分泌的試劑為Brefedlin A或Monensin。Th1/Th2細胞首先是CD4+T細胞，因此存在著用CD4來設定細胞群的問題。我們知道CD4不但在T 細胞上表達，還在所有的單核細胞上表達，因此單獨用CD4設門無法將CD4+T細胞區分開來。那么我們用CD3和CD4雙參數設門是否可以呢？回答是否定的。因為在佛波酯的刺激作用下CD4 抗原的表達會迅速下調，甚至完全喪失，所以不適合于設門。用CD3和CD8設門，因CD8不受佛波脂的影響且絕大多數CD3+CD8-的細胞都是CD3+CD4+細胞，因此可用CD3+CD8-細胞群來確定CD4+T細胞群。FITC標記CD8，PE標記IL-4和，PE-CY5標記IFN-r，APC或PE-CY7標記CD3。

流式細胞儀要求：488nm或633nm（僅限APC染料）光源，525nm、575nm、675nm，767nm濾光片。 ⑽、細胞增殖狀態檢測

核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量細胞增殖分裂狀況，在評估腫瘤預后有重要意義。