Horizon Dx RS (Reference Standard )標準品常見問題匯總

Q-Seq HDx RS

1 什么是Q-Seq HDx 標準品？

答：Q-Seq HDx標準品是通過精準基因編輯具有多種突變位點分子診斷檢測標準參照物，可直接應用于各種高通量分子診斷平臺,如：NGS, QPCR, ddPCR。其主要用途為評價每次檢測突變特異性和靈敏度以靈敏度的精確確認。

2 Q-Seq HDx 標準品是如何制作出來的？

答：通過提取自人的特異性無性繁殖細胞系的gDNA，來源于多種突變類型細胞系的gDNA進行一定比例的混合形成所需要的各種突變體標準品。對于特定位點變異均通過ddPCR的方法進行絕對定量。

對于Q-Seq FFPE HDx標準品，不同細胞系進行混合產生特定的多重突變株，然后進行輕度福爾馬林固定，固體石蠟均勻包埋而成，蠟塊隨后被切成單片型，每片提取DNA量預計≥400ng。

得率取決于FFPE提取方法；我們內部質控用的是Promega’s Maxwell LEV Plus FFPE extraction kit。另外，用于制作標準品的細胞系含有一些內源性突變，這些突變型非常適用于開發含有多種突變的比較大的panel。

3如何理解標準品中的AF等位基因頻率？

答：Allelic Frequency 是指含有變異基因的DNA在總的DNA中的比率，你看到我們幾乎所有的DNA或者FFPE的AF最高都是50%， 那是因為人類的染色體是雙倍體，即是兩條染色體，基因編輯的時候是在其中一條染色體上進行編輯，那么最后計算出了的比率就是50%， 也就是說只有一半的DNA是含有這個特定的突變位點的。50%以下的AF是通過和野生型的細胞的混合而來，比如一份50%的突變型細胞和一份野生型細胞混合后，得到的就是25%的AF。

4 Q-Seq HDx 系列產品規格如何？

答：Q-Seq HDx標準品的規格為1ug/管，濃度為50ng/ul; Q-Seq FFPE 標準品單片厚度為15-20um。單片預計提取≥400ng DNA。

5我怎么不能從標準品里檢測出某些或者所有預期的突變？

答：如果檢測不出突變，或者只能成功檢測出野生型，可能是因為引物設計位點在編輯位點之外，而導致突變株無法有效擴增。

為了確保您設計的引物序列包含在突變位點序列之中，可以在每一個產品的詳細信息中找到細胞編輯序列信息或者聯系我們的技術團隊進行索取編輯序列信息。 

Base-Seq HDx RS

1是否提供提取自FFPE切片的的DNA標準品？

答：是，我們很快將推出福爾馬林不同程度處理的DNA標準品產品，敬請期待。

2 Base-Seq HDx系列產品規格如何？

答：規格如下：野生型DNA標準品5ug/管；突變型DNA標準品1ug/管，濃度均為50ng/ul。

Base-Seq FFPE 標準品單片厚度為15-20um，單片預計提取≥400ng DNA。

3我的實驗對標準品濃度要求為5ng/ul,能對其進行稀釋嗎？

答：如果您的實驗需要濃度為50ng/ul以下，都可以使用適當的緩沖液對標準品進行稀釋。gDNA一律使用的是TE緩沖液 [Tris-EDTA (TE) buffer（Tris-HCl 10mM, 1mM EDTA, pH 8.0）]

4 如何使用Base-Seq HDx DNA標準品，通過建立標準曲線來檢測平臺或實驗的檢測線(LOD)？

答：不同的平臺和實驗有不同的檢測線（最低靈敏度）。一般來說，sanger測序方法靈敏度為15-25%之間，qPCR的最低靈敏度能達到大約1%，而NGS和ddPCR的靈敏度更高。根據Base-Seq HDx DNA標準品不同的應用類型，LOD的檢測線中的等位基因頻率也有所不同。制作LOD曲線，至少需要1管突變型DNA和1管野生型DNA標準品。

5 對于Base-Seq FFPE HDx標準品，是否有推薦的提取方法？

答：我們做過FFPE提取方法的比較，實驗表明，磁珠法提取能夠得到更高得率的DNA。作為內部質控，我們使用 Promega’s Maxwell LEV Plus FFPE 試劑盒來提取，得率可以達到400ng/FFPE以上。同樣我們也用過Qiagen’s QIAamp DNA FFPE tissue試劑盒柱式法提取過，發現得率為200~500ng/FFPE,得率稍低一些。

6 如果FFPE提取DNA得率低于預期值，應該如何提高得率？

答：不同操作人員及方法提取DNA得率有很大差異。如果一管FFPE標準品中沒有提取DNA或者得率小于50ngDNA,很有可能是因為二甲苯去石蠟化時細胞顆粒丟失隨后被洗脫掉。所以在二甲苯處理階段，務必保證在管子里能夠看到細胞顆粒（一小片細胞），在起始階段細胞沒有丟失。

如果提取出來的DNA只有50~200ng/FFPE，有可能是因為洗脫過程中在柱子里有一些殘留DNA。建議進行多次洗脫避免殘留。以我們的經驗來看，兩次50ul洗脫液洗脫比一次100ul洗脫液洗脫，DNA得率會更高。

CfDNA HDx RS

1 什么是cfDNA標準品？

答：眾所周知，cfDNA（也稱為ctDNA）臨床應用需要嚴格的檢測流程來確保平臺及操作精準度，同時由于體液中ctDNA含量極其微量，使得ctDNA的檢測方法還面臨著諸多挑戰。CtDNA的檢測通常需要檢測出極低的基因突變頻率，0.1%甚至是更低，這也推動這項技術的對檢測靈敏度的要求極高。目前使用標準品或者通用對照品來評價cfDNA/ctDNA分析流程受到了不同類型臨床樣本的極大制約。基于此，Horizon研制的cfDNA標準品系列為ctDNA檢測技術提供了一種創新標準化理念，其來源于人類基因編輯細胞系，以片段化的人類基因組DNA（平均大小160bp）方式提供，類似于人類血漿中的腫瘤NDA，由寬泛的突變范圍突變型（低至0.1%）以及配對的野生型組成。每個產品有確定的拷貝數濃度以及等位基因頻率來滿足您不同數量和質量樣本的驗證。這些產品極大推動了ctDNA檢測實驗和平臺的研發，驗證，以及性能評價的標準化。

2 為什么使用cfNDA標準品于我的實驗流程？

答：標準品有如下功能：

A 監控實驗流程

B 優化和驗證實驗

C 監測cfDNA分析平臺的檢測限

D cfDNA分析平臺穩定性

F 常規監控實驗和平臺的性能

G 流程化操作培訓

3 Horizon cfDNA標準品和其他腫瘤循環DNA標準品有何區別？

答：cfNDA檢測樣本是片段化的人類基因組DNA樣本，質粒和合成DNA不是理想的對照樣本，因為其不能真實的反映人類腫瘤樣本的復雜性。因此質粒作為樣本得到的結果沒有足夠的說服力。更多請見。。。

4 Horizon標準品是如何片段化的？

答：突變型gDNA提取自人類基因編輯細胞，并通過機械隨機打斷方法進行片段化，并且Horizon進一步優化SOP流程來保證批次穩定性。

5打斷后是否進行末端修復步驟？

答：Horizon未進行任何的末端處理，但是我們建議用戶建庫過程中進行此步操作。

6你們是否嘗試過其他方法制作此類標準品？

答：Horizon曾經嘗試過酶切片段化來制備標準品，但是由于批次間差異導致，這種方法打斷的標準品無法滿足生產需求，重復性比較低，片段化不穩定，所以我們選擇了可操作和穩定性都比較強的機械打斷來提高制備可重復性和生產穩定性。

7片段化程度有多大？

答：我們使用片段化分析儀以及D1000 Screen Tape 檢測該標準品，下表數據顯示cfDNA標準品均能被打斷成短片段（達400bp大小），而60%的產品具有類似于腫瘤循環DNA大小的100bp到200bp，并保證每一種規格的產品批次間穩定性。(如下表)

8 cfDNA標準品的質量是如何控制的？

答：每一批次產品進行以下流程質檢以確保產品穩定性和精準度。

9 我能用此標準品來做Spike in實驗嗎？

答：可以。標準品用于支持驗證實驗流程，同樣，也可以作為spike-in標準品來評價cfDNA提取流程。

標準品本身獨立使用，但如果有用戶利用標準品做spike-in實驗，我們建議將標準品摻入到健康人群血漿中。在進行spike-in實驗之前，我們建議用戶先用我們提供的標準評價一下在特定平臺和流程上的表現，而且確定摻入健康人群血漿的標準品的量。與我們提供的標準品相比，摻入后的標準品的突變率會變更低而且更復雜，這是因為正常人群血漿中存在著野生型cfDNA。

10 在做多重分析時，是否存在不同探針之間的競爭？

答：多重檢測標準品包括兩種非常相近的突變類型：NRAS Q61K和NRAS A59T. 當用多重標準品來檢測NRAS A59T時會看到有探針之間的競爭。比如，用2D plot ddPCR平臺檢測時會發現又多余的量，這可能是因為產生NRAS Q61K的突變的非特異性擴增。

11 我的檢測結果與預期結果很不一樣，為什么？

答：產品信息提供的是預期的突變頻率，Horizon是通過ddPCR檢測每一個產品的突變頻率。實際檢測結果與我們的預期結果不同取決于驗證實驗的設計，平臺和流程，更多問題請咨詢: technical@horizondiscovery.com

12 在cfDNA標準品中是否會發現其他突變類型？

答：對于這些標準品的內源性突變的信息，您都可以通過下載每一個產品的原始專利細胞系的全外顯子測序結果來獲取，或者在每個具體產品的界面鏈接下載。

13 能否購買其他客戶定制的標準品？

答：我們歡迎用戶選擇產品定制或者購買其他用戶定制的產品，但其價格和貨期取決于不同案子所需panel的復雜程度，詳情請詢：info@horizondiscovery.com

14 產品應用文獻請見：

https://www.horizondiscovery.com/media/resources/Application%20Notes/reference-standards/Allelic%20Frequency%20Measurement%20of%20Multiplex%20I%20cfDNA%20Reference%20Standard%20Set%20using%20Droplet%20DigitalTMPCR,%20Ion%20TorrentTMand%20MiSeqTM.pdf