關于引物的問題                                                                         

PCR 引物可以用于 RPA 嗎？ 可以。我們最近已經證實，在許多情況下，具有 PCR常用長度

（例如 18-23 個核苷酸）的引物可很好地用于 RPA。不過要注 意，反應動力學可能會稍慢，因此如果想要發揮RPA的優勢，在 10-15 分鐘內快速擴增，我們建議使用稍微長一些的引物（以及 更短的擴增子）。此外還要注意，對于決定寡核苷酸作為 RPA 引物的因素與決定寡核苷酸作為 PCR 引物的因素兩者之間的關 聯，目前尚無正式定論。

我可以使用現有的 PCR  探針嗎？

不可以。大多數常用的 PCR 探針系統不適合用于 TwistAmp? 檢測過程。具體地說，那些利用聚合酶的 5’ 至 3’ 核酸酶活 性的系統不能用于 TwistAmp? 系統，因為這種酶活性與 RPA 生物化學過程根本不相容。

我如何設計 RPA  引物？

可以通過官網上附錄（網址為 twistdx.co.uk）中詳細介紹的篩選 過程確定好的RPA引物。

我需要使用多少引物？

TwistAmp? Basic 反應的推薦引物濃度為每種 480nM 對于 TwistAmp? exo、TwistAmp? fpg  和 Twist Amp? nfo  試劑盒，推 薦引物濃度為每種 420nM。不過，稍微改變反應中某些引物對 的用量可以提高其性能，可采用滴定策略（每次從 200nM 到 600nM）來確定其特定引物對的最佳濃度條件。

我如何配置凍干探針？ 請參照寡核苷酸生產商關于探針配置和貯存的說明。

通常，將裝有凍干寡核苷酸的小管短暫離心以使 DNA 沉降于 小管的底部，加入適量的 T0.1E   緩沖液（10mM Tris-HCI     pH 8

，0.1mM EDTA）來制備 100μM 的貯備溶液。將溶液在室溫下 靜置 10 分鐘，并混合（震蕩）10 秒鐘。配置好的寡核苷酸探 針通常可在 -20°C  下長期貯存。

我需要使用多少探針？

反應中探針的推薦濃度為 120nM。不過，略微改變探針的濃度 有時會促進 TwistAmp? 反應。對不同的探針濃度（從 50nM 到 150nM）進行測試將優化基于探針的特定檢測的性能。

RPA 引物需要多長？

為了充分利用 RPA 的檢測速度和靈敏度，我們建議客戶使用至 少 30   個核苷酸長度的引物。通常情況下，引物長度在 32   至 35 個核苷酸之間。可使用較短的 PCR 長度引物，但是這類引物 的檢測速度和靈敏度可能不及較長的引物。

RPA 引物應當相距多遠？ 這取決于具體應用和需求。一般而言，我們建議在標準 TwistAmp? 試劑盒檢測條件下，兩個 RPA 引物產生的擴增子 長度通常不應超過大約 500bp。RPA 擴增產物的大小或許沒有 下限，不過根據RPA 引物的最小長度， 擴增子長度最小大約 80bp。為了獲得最快速的實時反應動力學，最終擴增子的理想長 度應為 100-200bp。在特別優化的情況下，生成的擴增產物長達 2kb。但是，標準的 TwistAmp? 試劑盒不容易產生這么長的擴增 子。請參閱附錄（網址為 twistdx.co.uk）了解有關引物設計和獲

得更長擴增子方法的詳細信息。

我需要篩選多少引物？ 這取決于您對檢測靈敏度的要求。舉例來說，如果您只需要每個 反應檢測 1000 個分子或以上，那么絕大多數引物對都夠用了。 對于極高靈敏度的檢測，最好是進行系統性的引物篩選以找到 好的 RPA 引物。最初篩選時，測試的引物對數量通常在 10 到 20 對之間。測試的寡核苷酸越多，找到能夠在快速動力學下檢 測單個分子的好引物對的幾率也就越大。 我可以在哪里獲得有關引物設計的更多詳細信息？ 有關引物設計的更多詳細信息，請參閱附錄（網址為 twistdx. co.uk/support）

我需要使用探針篩選引物嗎？ 不需要。任何檢測方法都可以用來評估和比較候選引物對的性 能。不過，就篩選高靈敏度的引物而言，用檢測探針對擴增進行 實時監控被證明是最快也是最省力的方法。

篩選引物時我應該使用什么樣的條件？ 理論上，引物篩選的條件應盡可能接近地模擬最終檢測時所要求 的條件（近似的模板拷貝數、樣本純度、多重檢測深度等等）。

可以提高給定引物的性能嗎？ 稍微改動一下引物的序列可以提高 RPA 性能。任何給定的引物 都可以通過以下方法進行優化：以單核苷酸為基礎略微改變引物 的長度；以及保持引物長度不變，以 1bp 為增量移動引物的位 置。經過改動的引物，需要重新進行擴增活性的測試。

怎樣才算是好引物？ 目前對于好引物還沒有確切的設計標準，所以需要進行篩選。

RPA 引物的解鏈溫度應該是多少？

由于 RPA 反應是在恒溫和 DNA 解鏈蛋白徹底改變 DNA 的解 鏈行為的條件下進行的，因此傳統的估算的解鏈溫度不直接適用 于該系統。

我該如何選擇探針？

如果使用適用于探針的其中一種 TwistAmp? 試劑盒，請參照附 錄（網址為 twistdx.co.uk）中描述的有關檢測探針的設計指南。 需要注意的是，使用首選的 TwistAmp? exo 探針系統在標靶區 域中選擇探針位置時，有一些序列限制。如果存在不合理的限 制，TwistDx 可幫助您設計備選檢測策略。備選的 TwistAmp? fpg 探針系統更容易提供靈活的探針設計，但它產生的熒光信號 有時不如 TwistAmp? exo   探針強。

引物需要進行任何特別純化嗎？ 在進行引物篩選的時候，通常不需要使用特別純化的寡核苷酸。 但與用于其他技術時一樣，我們注意到了引物制備質量的 批間差異。因此，對于一致性要求比較嚴格的應用，我們建議在 確定了好引物之后使用更純的引物。

經過一種 TwistAmp?    試劑盒測試的引物，能直接用于其他

TwistAmp? 試劑盒么？

不一定。如果您已使用 TwistAmp? Basic 試劑盒設計了引物， 用于 TwistAmp? exo 或 nfo 試劑盒時您還需要引入探針。這個 和其他因素意味著跑膠檢測、熒光檢測或側流層析檢測對引物的 最佳組合可能有不同的要求。通常情況下，我們發現，使用相似

序列的探針從 TwistAmp? exo 熒光檢測轉為 TwistAmp? nfo 側 流層析檢測能夠獲得相當可靠的結果。但是熒光檢測的最佳引 物/探針組合不一定是能夠提供最令人滿意跑膠檢測結果的引物 組合，反之亦然。從 DNA 檢測分析轉為 RNA 檢測的逆轉錄 分 析的情況更為復雜，因為逆轉錄酶和聚合酶對引物有著不同的偏 好。就這一點而論，我們建議使用逆轉錄系統在 RNA 模板上設 計 RNA   檢測，而不是在使用 DNA   試劑盒優化后嘗試轉為使 用 RT  試劑盒。

能直接用標記的引物和 TwistAmp? Basic 劑盒進行側流層析檢 測嗎？ 可以。您可以根據需要使用兩個經過修飾的引物來進行側流層 析檢測，但我們推薦使用探針和 TwistAmp? nfo  試劑盒。這是 因為 RPA 與 PCR 一樣，會受到引物二聚體形成的影響。如 果引物設計不完美，引物很容易發生交叉反應，生成假陽性結 果。TwistAmp? nfo  探針能夠避免這個問題，因為它們被封閉， 所以無法延伸形成探針-引物二聚體。nfo 酶只有在與互補鏈結 合時才能識別并切除無堿基位點 (THF)。切除無堿基位點意味 著，探針的封閉端可以脫落，探針可以充當引物，從而生成可被 側流層析試紙條檢測到的產物。因此，只有獲得所需的擴增子， 探針才能結合、被切割并延伸以形成帶有反向標記引物的產物。

RPA  支持生物素或熒光標記的寡核苷酸嗎?

支持。在 RPA 反應中，連有生物素或熒光團的引物與未修飾的 引物表現差不多。我們還沒有發現任何差異。

 多重檢測                                                                                   

TwistAmp? 反應能實現多重檢測嗎？ 可以。可以在同一個管中同時進行多個擴增反應。不過，多重化 的引物對組合需要精心設計，以便每個引物對都能同樣有效地工 作。需要注意的是，反應中的寡核苷酸總量 (nmol) 不要明顯 超出實驗方案中規定的量；如果在一個反應中使用兩個以上的擴 增引物，則應在所有存在的寡核苷酸之間分配不同引物的最大用 量。另外，同時監控多個擴增事件也需要不同的探針；多重檢測 對檢測設備以及熒光團兼容性的限制也必須予以考慮。

 定量                                                                                          

可以利用 TwistAmp? 反應對模板定量嗎？ 可以。特定檢測的擴增子達到可檢出水平的時間，取決于反應起 始時的模板量：初始模板的拷貝越多，擴增子就越快達到可檢 出水平。不過，利用這種“基于時間”的定量需要精心的實驗設 計，確保對照反應是同時開始的（例如，可以通過“鎂離子的添 加”進行控制）。相對“較慢”的擴增反應有助于更精確的定 量。減慢擴增反應速度的策略（包括合適引物的設計）在附錄（ 網址為 twistdx.co.uk）中討論。

 Twista  兼容性                                                                       

可以在 Windows 8  設備上運行 Twista?  嗎？

Twista?  與 Windows 8  系統不兼容，因此您必須安裝 Windows

早期版本（XP  Vista  或 7）的仿真程序才能運行 Twista。

 設置                                                                                          

試劑盒在運輸時處于常溫，它還能使用嗎？ 可以，試劑盒處于常溫下 2-3 周不會有問題，仍然可以使用。 如果您不確定，請運行對照測試并將結果發送給我們，我們將 能確定實際情況是不是這樣。對于長期貯存，我們建議貯存在

-20?C  下。

可以將再水化溶液的每一種成分直接依次添加到凍干的反應球 團中嗎？ 不可以。將一種引物或探針先于另一種加入體系將會導致重組復 合物的形成偏向先添加的寡核苷酸。這就是引物和探針必須同時 添加的原因。

可以將醋酸鎂添加到重懸緩沖液中嗎？

如果您在使用 TwistAmp? Basic、nfo 或 fpg 反應體系，是可以 添加的。 不過一旦加入鎂離子，反應組分就被激活。在最后用移液器將醋 酸鎂移取至反應中時，我們建議可將醋酸鎂添加到聯排反應管的 蓋子上并將其離心旋轉至反應體系中，如此您便可確保反應同時 開始，并將交叉污染或移液槍頭上殘留的任何反應殘液生成 RPA 產物的風險降至最低。

如果您在使用 TwistAmp? exo 或 TwistAmp? exo RT 反應體系， 則不可以添加。在有鎂離子存在時，引物和探針在受到重組酶和 單鏈結合蛋白保護之前可能被核酸外切酶破壞。這可能會導致反 應中出現很高的熒光基線。

可以制備預混液嗎？ 可以。如果您想建立多個反應，可以制備預混液。在篩選不同的 DNA 時，可以將重懸緩沖液、引物和探針（如使用）混合在一 起，并加入到凍干的反應物中進行重懸。然后將不同 DNA 加入 反應體系，最后照常用 MgAc 起始反應。在進行引物篩選時， 可以用重懸緩沖液、模板 DNA、探針（如果使用）和一個引物 制成預混液，并將其分裝到 1.5 ml 小管之后再分別加入不同的 引物。只有當兩個引物都存在時，才能重懸凍干的反應物，否則 會使重組復合物的形成偏向先添加的寡核苷酸。

 運行 RPA  反應                                                                       

TwistAmp?      試劑盒應在怎樣的溫度下使用？

標準的 TwistAmp? 試劑盒經過配置可在 37°C-42°C 的溫度范圍 內操作。過高的溫度會對反應體系產生不利的影響，因為酶會逐 漸地失去全部活性。在適當的條件下，RPA 過程本身可以在較 低的溫度下進行，但所提供的 TwistAmp? 試劑盒的制劑已針對 高反應動力學速度進行了優化，通常不兼容使用低于推薦范圍的 溫度條件的檢測方案。對于 RT 試劑盒，我們建議用戶在 40°C 下運行反應，因為逆轉錄酶在稍高的溫度下具有更高的活性。

如果要運行 TwistAmp?  反應，必須使用 Twista?  嗎？  不需要。 TwistAmp? Basic 和 nfo 試劑盒適用于任何能夠保持 37-42°C 的穩定溫度的設備。對于使用 TwistAmp? exo 試劑盒 進行的實時反應，可使用能激發并檢測所用熒光發色團并能保持 37-42°C 穩定溫度的任何孔板檢測儀或實時熱循環儀。注意，在 運行 RPA  反應時，蓋加熱功能應關閉。

可以使用 TwistAmp? Basic 反應的擴增子進行 TA 克隆嗎？ TwistAmp? Basic 反應中使用的聚合酶不具有編輯功能，擴增子 應該是可以用于 TA  克隆的。不過，我們尚未對此進行過測試。

可以在反應體系中加入更多/更少的再水化緩沖液嗎？ 不可以。加入比建議量更多或更少的再水化緩沖液會對 RPA 反 應的進行方式產生不利影響。緩沖液中包含 RPA 反應所需的成 分，因此加入更多或更少的緩沖液將會改變其在重懸球團中的最 終濃度。

 檢測                                                                                          

可以對擴增反應進行熒光終點分析嗎？

可以，但不包括使用 TwistAmp? exo 試劑盒或 exo RT 試劑盒的 情況。因為在擴增停止后，反應混合物中的核酸外切酶會消化掉 大部分的擴增產物。要分析擴增子，請使用 TwistAmp? Basic 試 劑盒。也可以對使用 TwistAmp?nfo 和 TwistAmp? fpg 試劑盒 生成的產物跑膠分析。注意，如果您想對這些產物進行跑膠分 析，可將 TwistAmp?nfo 試劑盒與 TwistAmp? exo 探針結合使 用，但反應動力學速度會變慢。

可以使用插入性染色劑 實時監控TwistAmp?  嗎？ 可以。插入性染色劑可以在 TwistAmp? 反應中進行定量和監 控。不過，就像 PCR 一樣，這種染料通常可以結合到任何雙鏈 DNA 上，因此引物噪音會產生假陽性信號。引物噪音在較低的 溫度下會更嚴重一些，而在 PCR 檢測中，測量插入性染料時的 溫度通常是引物二聚體熔解時的溫度。此外，TwistAmp? exo  試 劑盒中的核酸外切酶會在反應過程中消化大部分的擴增產物，因 此不推薦將插入性染料用于這類試劑盒。

跑膠之前需要回收 RPA  產物嗎？

需要。RPA 反應體系里的集聚試劑和蛋白會干擾正常的瓊脂糖 凝膠電泳，如果不進行反應產物回收，跑出來的可能是彌散條帶 而不是干凈的條帶。

在用側流層析試紙進行檢測之前需要稀釋 RPA 產物嗎？ 需要。RPA 反應體系里的集聚試劑和蛋白會干擾側流層析試紙 上的抗體，如果不進行充分稀釋就會出現非特異性結合和假陽 性信號。

在 TwistAmp? exo (RT) 反應即將結束時，有時會看到熒光急劇 增強，這正常嗎？

正常。在 TwistAmp? exo 反應中，聚合酶和核酸外切酶 III 處 于競爭關系。隨著反應的能量逐漸耗盡，核酸外切酶 III 開始 占據優勢，結果導致探針更快速地裂解和熒光信號出現劇增。

可以保存 TwistAmp?    反應產生的擴增子嗎？

可以，TwistAmp? Basic  或 nfo  反應體系的擴增子短期可以保存 在 4°C  下，長期保存在 -20°C   下。

TwistAmp? exo (RT) 反應的擴增子不能保存。如果在反應停止后 未經迅速的失活處理，核酸外切酶 III 很可能會消化擴增子。