重組桿狀病毒(rBV)是新型的體內和體外基因轉染載體，其介導的轉基因技術已廣泛應用于藥物篩選、腫瘤治療以及組織工程等領域。此外，rBV囊膜可用于蛋白質/多肽展示，即其可作為疫苗遞送平臺。

　　優化重組桿狀病毒，以作為哺乳動物細胞基因轉染工具的主要驅動力，是相比現有的基因導入載體，其具有諸多優勢，如對哺乳動物宿主無致病性、可容納更大量的外源基因插入以及可使用昆蟲細胞系穩定生產高滴度的產物。

　　但是桿狀病毒與眾不同的特性，特別是表面異質性和非球形的棒狀結構，對于建立穩定的下游工藝提出了較大的挑戰，特別是臨床級產品的制備。而且，為達到目的治療效果，體內臨床應用需要大量的病毒載體，并需有效去除污染物，后者可能會抑制轉導效率、導致宿主免疫反應、形成不必要的負作用。對效價和質量的要求，使重組桿狀病毒的生產，需要使用高效、可放大的純化和濃縮方法。

　　往常，收獲細胞培養液后，重組桿狀病毒的純化和濃縮需要一系列的離心/超速離心步驟。但是，超速離心方法相當耗時耗力，且容易導致感染力顯著下降，原因可能是病毒顆粒形成了不可逆的聚集，所以使用這種方法時，通常會出現低回收率、低重復性的結果。也有實驗使用體積排阻或陽離子交換層析進行純化，或使用磁珠對生物素化的載體進行濃縮，但在效率和可放大性上總有所欠缺。

　　進入臨床應用時，動物細胞培養來源的雜質是主要問題之一，包括宿主細胞DNA、宿主細胞蛋白以及內毒素。用于臨床實驗的病毒載體，如腺病毒或逆轉錄病毒，都需要多種下游純化步驟的結合，包括濃縮、捕獲及精制等，以將這些雜質降低至可接受的水平。

　　本文介紹一種基于膜技術的簡單、穩定、經濟的重組桿狀病毒下游純化策略，包括澄清、濃縮/洗濾等，其可顯著降低工藝時間和驗證成本，并便于向cGMP操作進行轉化。

　　實驗

　　Sf-9昆蟲細胞搖瓶培養，擴增后轉移至25L波浪式生物反應器。感染時活細胞濃度為1-2x10^6cells/mL，重組桿狀病毒感染復數約為每細胞0.1PFU。細胞活性至50%時，收獲病毒生產料液。

　　下游澄清使用0.65μm孔徑的mPES中空纖維切向流過濾膜，從含有重組桿狀病毒的上清液中去除較大的細胞顆粒及聚集物。然后再使用100kD中空纖維超濾膜濃縮至100ml后，再以D-PBS緩沖液進行洗濾換液。兩步操作均使用KrosFlo切向流過濾系統，通過KF Comm數據采集軟件記錄進樣、回流及濾液壓力等完整操作參數，同時在兩步操作中，通過自動背壓閥，分別控制濾液或跨膜壓力恒定，并根據實時剪切計算，調整循環流速，以維持病毒完整性及活性。

　　之后以陰離子交換膜層析進行病毒捕獲，再脫鹽、除菌過濾后獲得所需終產物。

　　實驗使用RT-qPCR以及流式細胞術分別檢測總病毒及感染性病毒滴度，并以HepG細胞系用作靶細胞系，檢測病毒轉導效率。此外，每步純化步驟后，使用SDS-Page和WB檢測樣品中蛋白含量。內毒素水平使用LAL法測試，并用電鏡分析rBVs完整性及形態，動態光散射法檢測樣品顆粒的水動力學粒徑。

　　結果

　　使用中空纖維切向流微濾進行澄清可替換離心，且結合使用可拋棄型封閉流路，可維持料液的無菌狀態，防止污染。由于桿狀病毒顆粒較大(60 x 300nm)，選擇較大的孔徑可降低過濾器內可能的病毒聚集和截留。 該步感染性病毒顆粒回收率可達>95%。

　　對于病毒產品的大規模純化和濃縮，切向流過濾是最常用的技術，其可同時降低低分子量雜質的含量。 操作時，最佳循環流速和跨膜壓等操作條件都需通過實驗優化，以降低膜污染及由其導致的產物損失。在桿狀病毒處理中，通常需控制TMP<10psi，避免膜表面凝膠層的快速形成。在優化的條件下，病毒回收率可達>75%，濃縮因子可達10倍以上。此外，雖然有報道顯示重組桿狀病毒對剪切應激的耐受性較好，但其仍是需要控制的主要條件之一。

　　在澄清及純化濃縮之后，為達到體內/外臨床測試的質量要求，產品需進一步處理，根據病毒特性，可使用離子交換工藝。

　　多個批次間的重復實驗確定了該方法的可重復性和穩定性，工藝總回收率及終產物純度與使用傳統方法相當或更優，而切向流過濾的其它優勢，還在于更短的時間內處理更大量的料液及可拋棄型使用，有利于cGMP操作。

　　KrosFlo Research 2i (KR2i)切向流過濾系統

　　仕必純KrosFlo Research 2i (KR2i)切向流過濾系統是仕必純新近推出的新一代全整合式切向流過濾系統，系統采用高精度蠕動泵，并整合了數據采集軟件，可實時監測完整工藝參數，方便記錄、分析和優化，保證工藝可重復性，并便于工藝放大。

　　系統流路采用標準接頭設計，可兼容不同構型的超濾、微濾單元，即可在一個系統上，完成多個步驟的操作。如采用仕必純定制式、可拋棄型流路，更可保證工藝無菌性，避免污染，簡化操作。