默瑞生物推出現貨（TwistAmp Liquid Basic kit/TwistAmp EXO kit）液態重組酶聚合酶擴增 (RPA)試劑盒，這些試劑盒非常適合需要不使用熱循環儀就能在15分鐘內完成 DNA/RNA 擴增的實驗室以及想要靈活構建試驗體系的研究人員使用。

TwistAmp??Liquid試劑盒提供經甘油穩定化處理的液態RPA試劑，該形態對于在實驗室執行 PCR 和其他基于酶的反應的任何人來說都非常熟悉。這些試劑各自裝于單獨的試管中，用戶可隨意從中移取任何量的酶混合液來構建自己所選的RPA反應體積，配制用于多次反應的預混液，或者以各種 RPA 組分比例進行實驗以優化試驗。

除了具有室溫穩定性的凍干態TwistAmp? RPA試劑盒這一旗艦產品，本次新推出的?TwistAmp? Liquid試劑盒是現場或定點試驗開發的理想之選。液體形態讓實驗室更容易地在日常工作中使用快速簡單的RPA法（該方法有時甚至采用與PCR相同的引物）取代 PCR法，以及更容易地開發出定制的試驗。

1. https://www.nature.com/articles/s41598-018-35636-5 

Development of real-time reverse transcription recombinase polymerase amplification (RPA) for rapid detection of peste des petits ruminants virus in clinical samples and its comparison with real-time PCR test 實時反轉錄重組酶聚合酶擴增技術（RPA）的研究進展

2.https://brill.com/view/journals/nemy/21/3/articlep243_2.xmlRecombinase polymerase amplification assay for rapid detection of the root-knot nematode Meloidogyne enterolobii重組酶聚合酶擴增法（RPA）快速檢測

3. http://www.chvm.net/EN/abstract/abstract7141.shtml?? 2017, Vol. 44 ?? Issue (11): 3270-3277.doi: 10.16431/j.cnki.1671-7236.2017.11.023Establishment of a Real-time Fluorescent Recombinase Polymerase Amplification (RPA) for the Detection of African Swine Fever Virus非洲豬瘟病毒實時熒光重組酶聚合酶擴增技術(RPA)檢測方法的建立

HADENG Chu-riya1,2, FAN Xiao-xu1, ZHAO Yong-gang1, WANG Shu-juan1, ZHANG Zhi-cheng1, GE Sheng-qiang1, LI Lin1, WU Xiao-dong1, WANG Zhi-liang1   

1. National Research Center for Exotic Animal Disease, China Animal Health and Epidemiology Center, Qingdao 266032, China;
2. College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,給養豬業造成了嚴重的經濟損失.本研究利用重組酶聚合酶擴增技術(RPA),針對ASFV B646L(p72)基因設計了3組引物和探針,并進行篩選、反應條件優化、靈敏性、特異性和重復性試驗,建立了實時熒光RPA方法.結果顯示,該方法在39℃、20 min內即可檢測10個拷貝的DNA分子,且與豬瘟病毒、豬圓環病毒2型、豬細小病毒、豬偽狂犬病病毒均無交叉反應,檢測5.5×106至5.5×100拷貝/μL共7個稀釋度樣品在各時間點的熒光強度,變異系數范圍在0.38％～28.30％.該等溫、快速擴增方法可用于ASFV的定性檢測,為中國ASFV感染的早期診斷提供技術支持,對疫情暴發后相應控制方案的制定具有重要意義.

1.https://journals.plos.org/plosone/article;id=10.1371/journal.pone.0166903RecombinasePolymerase Amplification Assay—A Simple, Fast and Cost-Effective Alternative to Real Time PCR for Specific Detection of Feline Herpesvirus-1 重組酶聚合酶擴增法（RPA）-一種簡便、快速、經濟的貓皰疹病毒-1特異性檢測方法

· Jianchang Wang,

· Libing Liu,

· Jinfeng Wang,

· Xiaoxia Sun,

Wanzhe Yuan 

2. https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac5011298Quantification of HIV-1 DNA Using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification 監測HIV的新型移動DNA檢測技術（RPA技術）

2014年6月9 訊 /生物谷BIOON/ --近日，刊登在國際雜志Analytical Chemistry上的一篇研究報告中，來自美國萊斯大學的科學家通過研究開發了一種簡便高準確率的檢測技術，來檢測患者機體中的HIV跡象及病情發展程度。

研究者Rebecca Richards-Kortum表示，當前用于診斷嬰兒HIV狀況的金標準就是依賴實驗室設備及當前可用的檢測技術來對其機體中的病毒載量進行監測，而本文中研究者則開發出了基于核酸的新型HIV檢測技術。

這項新型的檢測技術基于PCR的方法對重組聚合酶進行放大（RPA），從而取代了復雜的實驗室檢測步驟，其可以對血液中的遺傳標記物進行快速多重放大，從而使得病毒的遺傳標記物可以很容易被檢測到；利用qRPA檢測就可以對HIV DNA中的特殊序列進行熒光探針的靶向標記，從而使用機器進行定量檢測，最后通過對熒光DNA進行軟件分析就可以使得醫生們掌握HIV在患者機體中的動態信息。

Rohrman教授說道，我們可以通過放大內部陽性對照對測試進行校準，而且可以利用HIV序列的相同引物進行擴增，因此檢測實驗可以正常進行；這項新型技術可以幫助追蹤老年患者機體中的病毒載量，這對于臨床醫生們實時監測病人體內的HIV情況，從而來確定患者是否需要及時治療提供了一定的參考數據。

從臨床角度來講，基于DNA的HIV檢測可以在四個數量級上對HIV的病毒載量進行定量檢測，盡管當前研究者使用熱循環儀來進行檢測，但是研究者正在著力開發一種新型的檢測技術，使得整個操作步驟維持在室溫和體溫之間，從而確保實驗的通用性和準確性。

Q 20x核心反應mix有沉淀,是否影響其功能?

A在低溫保存時, 重組酶和輔助蛋白在50%甘油中20x核心反應mix中有時會發生可逆的共沉淀反應.所以在室溫融化混勻后離心使其返回溶液形式并不影響其功能。

Q 使用Liquid試劑盒做多重實驗，能否制備master mix?

A 可以。Oligos, 2x Reaction Buffer, water, dNTPs and 10x E-mix可以預先混合，置于冰上幾個小時，在很多實例中可以過夜保存（性能上有任何改變都需要客戶自行實驗和評價）。一旦加入20x核心酶，短期保存在冰上也是可以的。

Q 使用Liquid試劑盒如何提高重復率和RNA模板的擴增率?

A 先將RNA模板和醋酸鎂混合后加入反應體系中，RNA的三級結構會抑制逆轉錄酶的活性，所以加入RNA和醋酸鎂時，將兩者分別加到在管內壁兩側或者將醋酸酶加在管內蓋中，同時離心混入體系，這種操作會提高反應性能。

Q 在TwistAmp Liquid E-mix中有沉淀，還能使用嗎?

A 可以。少量磷酸肌酸會發生沉淀不會影響RPA反應，只需在實驗前通過渦旋將沉淀重懸離心即可。

Q 在使用Liquid試劑盒時，是否能夠使用dUTP/生物素（酰）化dUTP?

A 可以，請參考

http://dx.doi.org/10.7150/thno.15250 和 http://dx.doi.org/10.1186/s13148-015-0100-6

Q 最小的RPA液體反應體系是多少?

A 最小低至PL級，請參考

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0153359

Q 液體反應體系中需要加入多少dNTPs?

A 1.8mM(總)dNTPs 作為起始量即可。用戶也可以根據自身實驗優化濃度,有時1-12mM均適用。

Q 如何提高擴增曲線的可重復性?

A 優化擴增曲線考慮以下因素: 對于低拷貝數模板，不穩定擴增可能是因為達到檢測限或者是反應混勻程度不同（未混勻的反應擴增效率不佳）。另外，在低溫情況下存貯，重組酶和輔助蛋白在50%甘油情況下形成沉淀,也是可能導致不穩定擴增的原因。所以，20x核心反應mix在室溫下解凍并震蕩渦旋將使其成為液體，不影響其功能,并且有效提高擴增效率。不穩定擴增也可能是因為master mix量不足，在加入體系前，用戶必須保證震蕩后20x核心反應組分均一。

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