液態重組酶聚合酶擴增 (RPA) 試劑正式上市

近期，TwistDx推出了一系列全新的液態重組酶聚合酶擴增 (RPA)試劑盒，這些試劑盒非常適合需要不使用熱循環儀就能在15分鐘內完成 DNA/RNA 擴增的實驗室以及想要靈活構建試驗體系的研究人員使用。

TwistAmp??Liquid試劑盒提供經甘油穩定化處理的液態RPA試劑，該形態對于在實驗室執行 PCR 和其他基于酶的反應的任何人來說都非常熟悉。這些試劑各自裝于單獨的試管中，用戶可隨意從中移取任何量的酶混合液來構建自己所選的RPA反應體積，配制用于多次反應的預混液，或者以各種 RPA 組分比例進行實驗以優化試驗。

除了具有室溫穩定性的凍干態TwistAmp? RPA試劑盒這一旗艦產品，本次新推出的?TwistAmp? Liquid試劑盒是現場或定點試驗開發的理想之選。液體形態讓實驗室更容易地在日常工作中使用快速簡單的RPA法（該方法有時甚至采用與PCR相同的引物）取代 PCR法，以及更容易地開發出定制的試驗。

產品組成:

相關擴展試劑盒額外提供試劑:

v 100 μl 50x 外切酶 III (TwistAmp? Liquid exo/exo RT kits);

v 100 μl 50x 逆轉錄酶 (RT) (TwistAmp? Liquid Basic RT/exo RT kits);

v 100 μl of 陽性對照模板 (DNA with TwistAmp? Liquid exo/Basic kits, RNA with TwistAmp? Liquid Basic RT/exo RT kits);

v 45 μl of 陽性oligo mix (oligo mix consists of primers for Basic/Basic RT kits, primers plus a ?uorescently labelled exo probe in the exo/exo RT kits)

其他必需試劑(非試劑盒提供):

v ddH2O; dNTPs; 寡聚核苷酸; RNase抑制劑(僅用于RT試劑盒)

產品信息:

附: TwistAmp liquid試劑盒Q&A

Q 20x核心反應mix有沉淀,是否影響其功能?

A在低溫保存時, 重組酶和輔助蛋白在50%甘油中20x核心反應mix中有時會發生可逆的共沉淀反應.所以在室溫融化混勻后離心使其返回溶液形式并不影響其功能。

Q 使用Liquid試劑盒做多重實驗，能否制備master mix?

A 可以。Oligos, 2x Reaction Buffer, water, dNTPs and 10x E-mix可以預先混合，置于冰上幾個小時，在很多實例中可以過夜保存（性能上有任何改變都需要客戶自行實驗和評價）。一旦加入20x核心酶，短期保存在冰上也是可以的。

Q 使用Liquid試劑盒如何提高重復率和RNA模板的擴增率?

A 先將RNA模板和醋酸鎂混合后加入反應體系中，RNA的三級結構會抑制逆轉錄酶的活性，所以加入RNA和醋酸鎂時，將兩者分別加到在管內壁兩側或者將醋酸酶加在管內蓋中，同時離心混入體系，這種操作會提高反應性能。

Q 在TwistAmp Liquid E-mix中有沉淀，還能使用嗎?

A 可以。少量磷酸肌酸會發生沉淀不會影響RPA反應，只需在實驗前通過渦旋將沉淀重懸離心即可。

Q 在使用Liquid試劑盒時，是否能夠使用dUTP/生物素（酰）化dUTP?

A 可以，請參考

http://dx.doi.org/10.7150/thno.15250 和 http://dx.doi.org/10.1186/s13148-015-0100-6

Q 最小的RPA液體反應體系是多少?

A 最小低至PL級，請參考

 http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0153359

Q 液體反應體系中需要加入多少dNTPs?

A 1.8mM(總)dNTPs 作為起始量即可。用戶也可以根據自身實驗優化濃度,有時1-12mM均適用。

Q 如何提高擴增曲線的可重復性?

A 優化擴增曲線考慮以下因素: 對于低拷貝數模板，不穩定擴增可能是因為達到檢測限或者是反應混勻程度不同（未混勻的反應擴增效率不佳）。另外，在低溫情況下存貯，重組酶和輔助蛋白在50%甘油情況下形成沉淀,也是可能導致不穩定擴增的原因。所以，20x核心反應mix在室溫下解凍并震蕩渦旋將使其成為液體，不影響其功能,并且有效提高擴增效率。不穩定擴增也可能是因為master mix量不足，在加入體系前，用戶必須保證震蕩后20x核心反應組分均一。