近日，知名華人科學家張鋒教授與同事在《科學》雜志上發表論文，介紹了一種全新的CRISPR應用工具，用以檢測核酸。他和James Collins教授團隊，聯合將CRISPR-Cas13a改造成了靈敏度達到了阿摩爾級（aM，10的負18次方摩爾每升），可以檢測單分子的SHERLOCK技術。這一工具能快速檢測RNA或DNA分子，靈敏度甚至有望檢測出單個核酸，這一重磅研究對于科研與全球公共衛生有著極大的影響，該事件很快在生物圈內刷屏了。
就在大家在為張鋒大神歡呼雀躍，在為CRISPR-Cas13a叫好的時候。我們發現，讓SHERLOCK技術達到阿摩爾級靈敏度的不是CRISPR-Cas13a，是它的搭檔，另一個顛覆性的發明重組聚合酶擴增技術（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）。很少有報道提起她，她就那樣默默站在CRISPR-Cas13a背后。
RPA有多厲害？據說可以媲美PCR技術。什么是PCR？著名發明家Kary Mullis因為發明這個技術于1993年獲得諾貝爾獎。RPA技術被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術（由英國公司TwistDx Inc開發）。以此為基礎的TwistAmp? 核酸擴增產品，能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術對硬件設備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。如果張鋒和Collins教授的這項發明最終能造福人類，我們也應該記住RPA的發明人。
常規的PCR也可以擴增特定DNA片段，提高靈敏度，但是PCR對溫度的控制有很復雜的要求，要經歷高溫變性、低溫復性還有中溫延伸三個步驟。RPA就不需要這么麻煩，它的反應需要三種在常溫下有活性的酶，最適溫度在37-42℃之間，不需要變性過程，這樣就大大加快了擴增的速度。再加上不需要溫控設備，兩者共同打造了真正便攜式的快速DNA擴增技術。
不僅方便快捷，RPA更“迷人”的地方在于擴增量十分高，能夠將痕量的核酸（尤其是DNA）模板擴增到能夠可以檢測到的水平。痕量，顧名思義就是“該物質雖然存在，但只有‘痕跡’，無法用一般方法定量檢測，通常含量＜0.1mg”，所以大家就知道RPA有多厲害了吧？利用它可以從單分子得到大約1012的擴增產物。而且RPA還不需要復雜的樣品處理，及時環境限制，無法提取核酸，也難不倒它[4]。
利用RPA，在室溫中，樣品中DNA或RNA的含量就可以得到提升，一旦含量增加了，再將DNA轉化為RNA。如此，Cas13a就有資格進化成“SHERLOCK”了！
RPA技術答疑
▲RPA技術有哪些特性？
RPA的特性：快速檢測 15min進行單分子檢測試驗， 簡易包裝 穩定凍干形式試劑. 無需熱循環過程 擺脫任何儀器束縛. 便攜 設備要求低，貧瘠條件亦能 完成檢測
▲RPA能實現多重化嗎？
可以。RPA技術支持在同一個管中同時進行多個擴增反應。不過，多重化的引物組合需要精心設計，以便每個引物都能同樣有效的工作。需要注意的是，RPA反應的引物總量(nmol)最好不要超標太多。如果在一個反應中使用兩個以上的擴增引物，就應該控制不同引物的量。另外，我們應當事先考慮好檢測多個擴增事件的探針、設備以及熒光團的兼容性。
▲能否對模板進行定量？
可以。擴增子達到可檢出水平的時間，依賴于反應起始時的模板量。初始模板的拷貝越多，擴增子就越快達到可檢出水平。不過，這種定量需要精心的實驗安排，確保對照反應是同時開始的。舉例來說，可以利用鎂離子的添加時間進行控制。因為鎂離子一旦進入體系，RPA反應就會開始。
此外，較慢的擴增過程有助于更精確的定量。我們可以通過調整反應條件或引物設計來減慢RPA的反應速度。
▲能否進行熒光終點分析？
可以。這樣比較的是反應開始時的熒光和反應結束時的熒光，熒光增強意味著發生了擴增。
▲能否支持生物素或熒光標記的寡核苷酸？
支持。在RPA反應中，連有生物素或熒光團的引物與未修飾的引物表現差不多。據悉還沒有發現任何差異。
▲跑膠前需要回收RPA產物嗎？
需要。RPA反應中的物質會干擾瓊脂糖電泳，如果不進行產物回收，跑出來的帶會出現拖尾。
RPA核酸檢測系列最新應用
犬內臟利什曼病POCT檢測 A Novel Molecular Test to Diagnose Canine Visceral Leishmaniasis at the Point of Care A Castellanos-Gonzalez, O.A. Saldarriaga, L. Tartaglino, R. Gacek, E. Temple, H. Sparks, P. C. Melby, B.L Travi Prduct used：TwistAmp nfo kit Paper Link： http://www.ajtmh.org/content/early/2015/07/30/ajtmh.15-0145.abstract
RPA用于全基因組和基因特異性DNA甲基化檢測 Colorimetric detection of both total genomic and loci-specific DNA methylation from limited DNA inputs Eugene J.H. Wee, Thu Ha Ngo, Matt Trau Prduct used：TwistAmp basic kit Paper Link： http://www.clinicalepigeneticsjournal.com/content/7/1/65 埃及血吸蟲病RPA擴增及寡色譜測流試紙檢測 Isothermal Recombinase Polymerase amplification (RPA) of Schistosoma haematobium DNA and oligochromatographic lateral flow detection A. Rosser, D. Rollinson, M. Forrest, B. L Webster Prduct used：TwistAmp basic kit；TwistAmp nfo kit Paper Link： http://www.parasitesandvectors.com/content/pdf/s13071-015-1055-3.pdf
